高分文献中的定量Western Blot是如何实现的?
2023-11-11 阅读 98
定量Western Blot是一种用于测量蛋白质表达水平的方法。下面是实现定量Western Blot的一般步骤：
1. 样品制备：将需要检测的细胞或组织样品进行裂解，并提取蛋白质。可以使用细胞裂解液或蛋白质提取试剂盒来完成这一步骤。
2. 蛋白质浓度测定：使用比色法或其他方法测定蛋白质的浓度，以便在后续步骤中加载相同数量的蛋白质样品。
3. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品按照浓度加载到聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）孔中，并进行电泳分离。根据蛋白质大小，将其分离成不同的带状条带。
4. 转膜：将分离后的蛋白质从凝胶转移到聚合物膜上，通常使用半湿式或干式电转膜系统。转膜后，蛋白质将被固定在膜上。
5. 阻断：将膜放入阻断缓冲液中，以防止非特异性结合。通常使用牛奶或酪蛋白等蛋白质作为阻断剂。
6. 抗体孵育：将特异性一抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合。孵育时间和温度根据抗体和目标蛋白质的特性而定。
7. 洗涤：用缓冲液洗涤膜，以去除非特异性结合的抗体和其他杂质。
8. 二抗孵育：加入与一抗体来源动物不同的二抗体，该二抗体与一抗体结合。二抗体通常与酶或荧光染料等标记物结合，以便后续检测。
9. 洗涤：用缓冲液洗涤膜，以去除非特异性结合的二抗体和其他杂质。
10. 信号检测：使用化学发光或荧光检测方法，检测标记的二抗体与膜上目标蛋白质的结合。这些方法可以定量测量目标蛋白质的表达水平。
11. 数据分析：根据检测到的信号强度，可以使用图像分析软件或其他方法对蛋白质的表达水平进行定量分析。
需要注意的是，定量Western Blot的准确性和可靠性取决于多个因素，包括抗体的特异性和效率，标准品的选择和使用，以及实验的重复性等。因此，在进行定量Western Blot实验时，需要严格控制实验条件，并与其他定量方法进行比较验证结果。
更新于 2023年11月11日
