为什么我的目的片段（2000bp）左右和pK18mobsacb连接总是不成功，求解，真的连了无数次了?
2023-07-01 阅读 33
连接目的片段和载体常常会遇到一些挑战，以下是一些可能导致连接不成功的原因和解决方法：
1. 片段酶切不彻底：确保目的片段和载体都经过充分的酶切。使用高质量的酶和适当的酶切条件，可以提高酶切效率。
2. 片段和载体的兼容性：确保目的片段和载体之间的酶切位点是兼容的。检查目的片段和载体的序列，确保它们之间没有不兼容的酶切位点。
3. 目的片段和载体的配对：选择适当的连接方法和载体，确保它们之间的相容性。不同的连接方法可能适用于不同的目的片段和载体。
4. 目的片段和载体的纯度：纯度低的DNA可能会影响连接效率。使用纯化的DNA样品，如凝胶纯化或商业纯化试剂盒，可以提高连接效率。
5. 过程条件：确保在连接过程中使用正确的反应条件，如适当的酶切缓冲液、温度和时间。跟随连接试剂盒的推荐方案，并进行优化。
6. 过量的目的片段或载体：在连接反应中，过量的目的片段或载体可能会导致连接产物的竞争性自连接。确保使用适量的目的片段和载体，根据推荐的比例进行配比。
7. 检查连接产物：在连接反应后，进行电泳检查连接产物。如果连接不成功，尝试优化连接反应的条件，或者考虑其他连接方法，如重组酶切和连接法。
如果你已经尝试了以上方法，仍然无法成功连接，可能需要重新评估实验设计和方法。你也可以咨询其他实验室的同行，或者尝试使用其他连接方法或载体。
更新于 2023年07月03日
